The pengendara sepeda termal adalah mesin dengan yang PCR dilakukan, untuk mempelajari lebih lanjut tentang hal itu Anda bisa melihat artikel kami (reagen PCR) di sini. Rimero, sampel DNA atau RNA yang akan diamplifikasi disiapkan, dimurnikan dan dicampur dengan reagen yang diperlukan untuk melakukan PCR. Pada saat itu tabung, sekitar 150 mikroL, siap dimasukkan ke dalam siklus termal untuk amplifikasi.
Sekitar 96 sampel dapat ditampung dalam thermal cycler.
Secara tradisional, amplifikasi rantai basa nitrogen dilakukan dalam tiga langkah .
Sebelum memulai siklus amplifikasi, langkah sebelumnya dilakukan . Di dalamnya sampel dibawa ke suhu di atas 90 derajat Celcius, biasanya 94-98 ° C , sehingga dua untai terdiri dari rantai DNA nitrogen atau RNA, dipisahkan dan juga Membatalkan setiap konformasi sekunder diberikan kepada DNA, circularizations atau pasangan dari untai dengan dirinya sendiri. Langkah ini memakan waktu lama untuk memastikan pemisahan semua motif yang mungkin telah terbentuk, antara 30 detik hingga 2 menit.
Siklus amplifikasi :
Langkah pertama sekali lagi merupakan langkah denaturasi , yang walaupun tidak terlalu penting pada siklus pertama, akan memisahkan untaian yang telah terbentuk pada siklus berikutnya. Langkah ini juga biasanya dilakukan pada suhu tinggi, 94 atau 98 C dan berlangsung sekitar sepuluh detik.
Langkah kedua adalah penyelarasan oligos atau primer pada template strand yang ingin kita amplifikasi. Langkah ini berlangsung sekitar 20 detik dan dilakukan pada suhu yang bervariasi , karena tergantung pada urutan primer yang digunakan. Dalam bahasa Inggris langkah ini disebut annealing, dan sering diterjemahkan terlalu harfiah sebagai cincin.
Primer adalah urutan kecil dari sekitar 20 nukleotida yang telah kita beli atau produksi yang akan mengikat urutan yang ingin kita perkuat. Primer mengenali urutan gen yang kita minati, menempel padanya dengan pasangan basa homolog dan gen disalin melalui aktivitas pemanjangan polimerase. Primer sering digunakan berpasangan, satu untuk menyalin untai positif dan yang lainnya untuk untai negatif.
Seperti yang kami katakan, suhu langkah ini bervariasi, tergantung pada primer. Pabrikan yang memasoknya biasanya menambahkan beberapa informasi tentang oligo. Seperti persentase GC atau “Tm”, suhu leleh , di mana secara teoritis setengah dari untaian membentuk rantai tunggal, yaitu suhu di mana primer tentu tidak memiliki konfigurasi sekunder. Untuk alasan ini, suhu yang sedikit lebih tinggi dari Tm digunakan untuk langkah ini, yang sering kali merupakan suhu yang berkisar antara 55ºC dan 65ºC hingga 72ºC.
Langkah ketiga adalah, secara logis, pemanjangan untai ganda 20 pasangan basa yang dibuat pada langkah sebelumnya, untuk ini digunakan suhu sekitar 72ºC , yang merupakan suhu kerja optimal Taq polimerase dan polimerase lainnya, meskipun polimerase biasanya disertai dengan spesifikasi penggunaan yang disebutkan. Perpanjangan memiliki waktu variabel , yang disarankan satu menit per kilobase , seribu basa, dari gen yang ingin kita amplifikasi dan Taq direkomendasikan untuk urutan pendek hingga maksimum 4 Kb, karena sejak saat itu kehilangan efisiensinya.
Setelah langkah ini, yang paling sering adalah kembali ke langkah pertama 98ºC selama 10 detik dan ulangi siklus antara 30 dan 45 kali .
Pada akhir siklus, langkah panas biasanya ditambahkan, 72ºC selama sekitar 7 menit untuk memisahkan untai DNA dari polimerase dan primer . Setelah itu dibiarkan dalam langkah dingin , antara 15 dan 4ºC dengan waktu tak terbatas , untuk menjaga sampel dalam kondisi baik sampai dikumpulkan.