Dalam biologi molekuler, suatu teknik digunakan untuk memisahkan dan mengisolasi protein , yaitu Western blot atau hibridisasi barat . Berkat teknik ini, kita dapat memisahkan protein dengan berat molekul yang diketahui dari sampel jaringan makhluk hidup mana pun (yang merupakan campuran kompleks dari semua protein yang disintesis dalam jaringan itu).
Western blot adalah teknik yang analog dengan Southern blot , yang dapat Anda baca lebih lanjut di artikel yang kami persembahkan di sini . Blot Selatan ditemukan oleh Edwin Southern, Ph.D. dalam biologi dan digunakan untuk mendeteksi urutan DNA tertentu . Nama tekniknya, Western blot, mengacu pada kesamaan prosedural dan terutama intelektualnya dengan Southern. Tes serupa lainnya adalah Northern blot untuk memisahkan urutan RNA dan Estern blot untuk RNA yang dimodifikasi selama transkripsi.
Hal pertama yang dilakukan western blot adalah mendapatkan sampel jaringan segar . Biasanya ditempatkan dalam nitrogen cair untuk pembekuan cepat. Dengan cara ini kita menghindari degradasi protein. Ini diikuti dengan menambahkan buffer (saline buffer) yang mengandung beta-mercaptoethanol , yang mencegah protein terdegradasi . Pada titik ini sampel dihomogenkan , sampel secara mekanis dipecah untuk memecahkan membran sel dan untuk melarutkan protein dalam buffer.
Setelah protein diekstraksi, sampel dimasukkan ke dalam gel poliakrilamida vertikal . Poliakrilamida adalah polimer umum dalam elektroforesis (teknik untuk memisahkan molekul dengan muatan listriknya). Arus listrik menyebabkan protein yang terkandung dalam sampel bermigrasi melalui gel poliakrilamida pada kecepatan yang berbeda tergantung pada berat molekul dan potensi listriknya. Menjadi protein terbesar (yang akan memiliki lebih banyak muatan) yang bermigrasi paling sedikit ke kutub positif . Dengan cara ini, kolom diperoleh dengan protein yang dipisahkan oleh berat molekul.
Langkah selanjutnya adalah mentransfer protein ke membran berpori steril (terlihat seperti kertas tebal). Bagian ini dikenal sebagai ” blot ” dan umum untuk semua teknik yang disebutkan di awal artikel. Juga melalui aliran listrik , protein dibuat untuk bergerak, kali ini secara horizontal, dari gel poliakrilamida ke membran .
Akhirnya, jika protein yang akan diisolasi diketahui , dilakukan imunodeteksi . Pertama, membran diblokir dengan susu atau produk serupa dengan kandungan protein tinggi yang tidak spesifik . Membran kemudian akan dicuci dengan buffer, membran tidak boleh kering dan akan ditempatkan dalam suspensi antibodi terhadap protein spesifik kita. Antibodi ini akan dibuat pada tikus, tikus, kambing atau kelinci , secara normal. Setelah inkubasi yang lama dengan antibodi, kelebihan antibodi dicuci lagi. Akhirnya, antibodi digunakan untuk melawan antibodi hewan yang disentuhnya , antibodi kedua ini biasanya memiliki beberapa jenis zat yang melekat yang bereaksi terhadap cahaya atau mampu membuat pelat fotografi.
Pada akhirnya membran dikembangkan dengan solusi fotografi dan film fotografi diekspos dalam gelap. Jika semuanya berjalan dengan baik, kami akan mendapatkan pita secara eksklusif pada ketinggian ukuran protein yang diharapkan.
Teknik ini sering digunakan dalam penelitian ilmiah untuk, misalnya, menunjukkan bahwa suatu jaringan mengekspresikan protein tertentu .