Dalam sebagian besar karya ilmiah saat ini di bidang biologi, dan khususnya biologi molekuler , penting untuk melakukan beberapa jenis eksperimen yang memerlukan PCR.
PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction . Reaksi berantai yang dilakukan oleh polimerase ini memungkinkan untuk mengamplifikasi sepotong DNA, diketahui atau tidak, yang kemudian dapat dilihat dan diisolasi dari gel agarosa dan etidium bromida (BrEt), zat yang diapit di antara putaran DNA. helix dan yang memungkinkan visualisasi dengan sinar UV.
Inilah yang harus ada dalam tabung di mana PCR akan dilakukan, semua ini direndam dalam air murni, dari jenis MiliQ
Ide proses ini, kunci untuk pengembangan eksperimental dalam sains, berasal dari pikiran Kary Mullis , yang dianugerahi Hadiah Nobel Kimia pada tahun 1993 untuknya.
The amplifikasi segmen DNA atau RNA dalam PCR dilakukan dalam thermocycler , mesin yang bervariasi suhu internal mengikuti siklus ditugaskan oleh peneliti, cara ini tabung yang ditempatkan dalam perubahan piring mereka suhu mereka untuk memfasilitasi satu atau proses PCR lainnya.
¿ Apa yang dibutuhkan untuk membuat PCR ?
Reagen yang diperlukan untuk melakukan PCR sangat “sederhana”. Pertama-tama, kita membutuhkan enzim polimerase yang mampu menyalin urutan nukleotida, ada berbagai macam polimerase dengan kapasitas dan efisiensi yang berbeda ketika bekerja dengan suhu yang berbeda atau tidak salah mengira basa yang diperkenalkan. Yang paling umum adalah polimerase dari bakteri Thermus aquaticus , disingkat Taq , mampu beroperasi pada suhu tinggi dengan presisi 1 kesalahan per juta pasangan basa, meskipun urutan yang disarankan untuk diamplifikasi adalah 1000 pasangan basa untuk meminimalkan kesalahan. Untuk mencapai fidelitas tinggi, biasanya menggunakan Phusion polimerase , jauh lebih mahal, tetapi jauh lebih cepat dan dengan frekuensi kesalahan yang lebih sedikit.
Kedua, nukleotida individu yang akan digunakan polimerase untuk membentuk untai salinan diperlukan. Nukleotida harus dalam bentuk dNTPs (deoxyribonucleotides triphosphate).
Selain itu, buffer digunakan , larutan spesifik yang memperbesar aktivitas polimerase, biasanya mengandung magnesium klorida .
Tetapi agar polimerase berfungsi, urutan untai ganda harus ada dengan ujung 5 ‘untai tunggal . Untuk mencapai ini, oligo digunakan, sekuens kecil nukleotida, antara 20 dan 50 basa, yang akan bergabung dengan DNA kita. Oligos ini, yang kami sebut primer , karena merekalah yang bergabung terlebih dahulu, dapat berupa urutan yang diketahui dalam gen yang diinginkan (diambil dari database genom dan dibuat untuk keperluan tersebut) atau oligo ini dapat berupa oligo basa acak , bila Anda mau untuk meningkatkan jumlah salinan semua DNA atau RNA yang dikandung sampel. Sebagai rasa ingin tahu untuk mengambil hanya messenger RNA, mRNA, oligo poliT kadang-kadang digunakan , yang akan mengikat ekor poliA dari RNA yang akan diterjemahkan.
Tentu saja salah satu hal terpenting untuk ditambahkan ke dalam campuran sebelum dimasukkan ke dalam thermal cycler adalah DNA atau RNA yang ingin Anda salin . Jika sampel yang dimasukkan adalah RNA, yang akan kita peroleh adalah cDNA, salinan DNA, yang akan memiliki timin, bukan urasil.
Langkah-langkah yang diambil di dalam siklus termal untuk melakukan amplifikasi materi genetik ini, baca di sini .