Hibridisasi in situ fluoresen

Hibridisasi in situ adalah cara paling langsung untuk mempelajari lokasi kromosom dari sekuens DNA (tunggal atau berulang). Preparat kromosom metafasik dengan DNA terdenaturasinya dapat dilihat. Pelabelan fluoresensi: IKAN (hibridisasi fluoresensi in situ) menggunakan fluorokrom sebagai agen interkalasi (diselingi dalam untaian DNA). Sebuah fluorochrome adalah zat yang dapat berpendar, seperti stiker glow-in-the-dark. Kurang digunakan saat ini karena bahaya yang ditimbulkannya adalah hibridisasi in situ dengan zat radioaktif.

Teori di balik teknik ini adalah bahwa penyelidikan berlabel (berurutan, dikenal dan diciptakan oleh peneliti, DNA terkait dengan satu atau lebih molekul fluorochrome) akan mengikat ke urutan homolog yang ditemukan dalam DNA masalah kita. Untuk ini, Anda harus dapat mengakses kromatin. Itulah sebabnya hal pertama yang harus kita lakukan adalah memperbaiki DNA masalah kita pada slide untuk mikroskop fluoresensi, itu juga harus didenaturasi, biasanya dengan formamida, sehingga dua untai heliks ganda dipisahkan.

The deteksi mungkin langsung : fluorochrome langsung melekat probe DNA.

Dalam deteksi tidak langsung : probe dilekatkan pada molekul yang, dengan teknik imunohistokimia, akan berikatan dengan antibodi yang akan memiliki fluorokrom yang terpasang. Metode tidak langsung memiliki keuntungan yang memungkinkan peningkatan jumlah molekul fluorokrom per DNA, membuatnya lebih terlihat di bawah mikroskop, lebih stabil dan pendaran tidak menurun, tetapi jauh lebih mahal.

Probe ditandai untuk deteksi tidak langsung dengan biotin atau digoxigenin, dan untuk deteksi langsung dengan fluorochrome, misalnya: Fluorescein (yang berpendar dalam warna hijau), DAPI (biru), Rhodamin (merah) atau Texas merah (merah), yang paling umum. Di bawah kondisi hibridisasi probe menempel pada DNA uji dan probe berlebih dicuci.

Probe harus berukuran besar (~ 40 kb), umumnya disintesis di kosmid. Kekuatan resolusi beberapa megabase (1Mb = 1.000.000).

Kegunaan: mengetahui urutan gen adalah cara mudah untuk menemukan gen analog pada spesies lain tanpa harus mengurutkan seluruh genomnya. Ini memungkinkan pemetaan urutan beberapa gen relatif satu sama lain atau melihat gen mana yang terlibat dalam perubahan atau mengidentifikasi setiap kromosom melalui urutan tertentu (yang memberikan warna berbeda). Berkat metode ini, dapat dilihat, misalnya, bahwa kromosom 19, yang memiliki kepadatan gen tertinggi, terletak di tengah nukleus, karena memiliki aktivitas transkriptomik lebih banyak daripada kromosom lain. Di sisi lain, kromosom 18, yang memiliki kepadatan gen yang sangat rendah, diamati terletak di pinggiran nukleus. Hal ini juga memungkinkan untuk mempelajari hubungan evolusioner antara kromosom, menggunakan potongan besar kromosom atau kadang-kadang seluruh kromosom: misalnya, probe kromosom 8 manusia berhibridisasi dengan urutan kromosom platarrhine (primata Amerika). Atau dapat dilihat bahwa kromosom 7 manusia yang besar mempertahankan posisi relatif gennya pada kromosom simpanse yang sesuai.

Oleh karena itu, dapat ditegaskan bahwa hibridisasi fluoresen in situ telah membawa kemajuan besar dalam identifikasi penyakit dan pengetahuan tentang fungsi nukleus tidak hanya selama pembelahan sel tetapi juga ketika kromosom didekondensasi.

Scroll to Top