Manusia secara tidak sadar telah mencampurkan molekul DNA dari asal yang berbeda sejak zaman kuno. Berbagai varietas hewan peliharaan, seperti jenis anjing atau sapi, atau varietas serealia atau pohon buah-buahan, telah dipelihara dan digandakan dalam kondisi yang sangat berbeda dari yang terjadi di alam, kadang-kadang sebagai hasil pertukaran antar varietas. yang awalnya berjauhan sehingga tidak mungkin mereka akan bergabung kembali secara alami. Ini adalah bentuk pertama manipulasi genetik, meskipun sangat primitif dan berbahaya.
Enzim restriksi memotong DNA meninggalkan ujung lengket
Dari penemuan molekul DNA hingga 1970, manipulasinya sangat sulit. Molekul DNA sangat panjang dan rapuh, dan dalam kondisi normal mereka pecah ketika dimanipulasi. Hanya dengan memipetkan larutan DNA menyebabkan ukuran molekul berkurang setengahnya.
Sejak tahun 1970, serangkaian teknik yang dikenal sebagai teknik rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan telah dikembangkan, yang memungkinkan kita untuk memanipulasi DNA organisme apa pun dengan relatif mudah. Artinya, kita dapat mengambil fragmen DNA dari makhluk hidup, memodifikasinya, menggabungkannya dengan fragmen DNA lain dari asal yang berbeda dan memasukkannya ke dalam makhluk hidup lain untuk diekspresikan di dalamnya.
Jika abad kesembilan belas adalah abad kimia dan abad kedua puluh fisika, tidak diragukan lagi abad kesembilan belas adalah dan akan menjadi abad biologi, karena teknik saat ini jauh melebihi yang asli dari tahun 70-an. memiliki nilai mereka dan kami akan merujuk kepada mereka.
Enzim restriksi.
Sekitar tahun 1970, enzim yang ada pada bakteri tertentu ditemukan yang mampu memecahkan DNA asing yang dapat menginfeksi mereka. Nuklease restriksi ini memecah DNA dengan mengenali urutan spesifik di dalamnya dan oleh karena itu menghasilkan fragmen yang sama dalam DNA yang diberikan. Begitu enzim dan urutan pemotongannya diidentifikasi, mereka menjadi “gunting molekuler” yang sesungguhnya di tangan insinyur genetika.
Lebih dari 100 endonuklease restriksi yang berbeda diketahui, yang masing-masing memecah menjadi urutan yang berbeda. Selain itu, mereka telah dikomersialkan secara industri sejak akhir abad ke-20, membuat pekerjaan para peneliti dan ahli genetika menjadi lebih mudah.
Dengan memecah molekul DNA, beberapa enzim restriksi memotong kedua untai DNA pada nukleotida yang sama, tetapi ada banyak enzim restriksi yang memotong setiap untai di tempat yang terpisah dan dengan demikian menghasilkan ujung kohesif (lengket)., yang akan memungkinkan DNA molekul yang membawanya untuk membentuk ikatan hidrogen dan cenderung saling menempel. Situasi ini memungkinkan fragmen DNA dari asal yang berbeda untuk bergabung, asalkan mereka telah dipecah dengan enzim restriksi yang sama.
Pemisahan fragmen DNA
Fragmen DNA dapat dipisahkan dengan elektroforesis pada gel agarosa, memanfaatkan mobilitas listrik yang memberikan molekul muatan fosfat negatif. Molekul cenderung terpisah menurut ukurannya; yang lebih panjang bermigrasi lebih lambat melalui pori-pori gel dan yang lebih kecil melakukannya lebih cepat dan dapat melakukan perjalanan lebih jauh.
Setelah fragmen yang tersisa dari pencernaan restriksi nuklease telah dianalisis, langkah selanjutnya adalah mengurutkan fragmen yang dihasilkan dalam molekul DNA sampai peta fisik molekul dibangun. Penguraian oleh beberapa nuklease yang berbeda sangat memudahkan tugas pengurutan fragmen. Teknik ini membantu kita menemukan urutan (sequence) suatu fragmen DNA yang diberikan.