Teknik persiapan
Mendapatkan persiapan yang baik adalah hasil dari pro – cess, lebih atau kurang rumit, di mana utili – Zan berbagai teknik seperti ikat , inclu – sion , pewarnaan dan dipotong . Jika pengamatan dilakukan dengan sel hidup, perlu menggunakan pewarna yang tidak berbahaya bagi mereka, seperti merah netral atau biru metilen.
Tetapi lebih umum untuk melakukan analisis dengan sel-sel mati yang mempertahankan morfologi dan komposisi kimianya. Untuk ini, fiksatif digunakan , solusi yang bekerja pada bagian protein sel. Memperbaiki adalah dengan finali – ty memperkuat struktur selular, menciptakan ikatan antarmolekul baru sehingga struktur selular yang diubah sedikit sebagai mungkin. Sampel yang disiapkan untuk mikroskop elektron difiksasi dengan osmium tetroksida.
Setelah fiksasi, perlu untuk membuat potongan halus yang memungkinkan pengamatan. Untuk ini, inklusi dibuat yang mengeraskan sampel dan memfasilitasi pemotongan. Parafin digunakan untuk mikroskop cahaya dan resin untuk mikroskop elektron.
Pemotongan dilakukan dengan mikrotom dan ultramikrotom .
Sampel diperoleh, ditempatkan pada portaobje – batuk (kotak logam saat menggunakan mikroskop elektron). Sebelum melakukan pengamatan mikroskop opti – co, Anda dapat melakukan pewarnaan agar memudahkan pengamatannya.
Teknik pewarnaan.
Untuk melanjutkan pewarnaan, pertama-tama kita harus menghilangkan semua jejak parafin yang telah kita gunakan untuk mengeraskan sampel dan melakukan pemotongan. Hal ini mutlak diperlukan karena parafin bersifat impermeable terhadap air dan pewarna yang kami gunakan larut dalam air. Oleh karena itu, setelah dewaxing, kami akan melanjutkan untuk melakukan hidrasi lambat, dengan beberapa langkah perantara.
Saatnya untuk menerapkan pewarna yang diinginkan. Sampel akan ditempatkan di dalam pewarna (atau setetes pewarna pada sampel jika kecil) untuk waktu yang cukup, biasanya antara 2 dan 10 menit. Kami akan melanjutkan untuk mencuci pewarna berlebih. Jika kita menggunakan beberapa pewarnaan, sekarang saatnya untuk mengulangi langkah terakhir ini dengan masing-masing noda yang diinginkan. Sampel dengan demikian tetap ternoda.
Ada berbagai jenis pewarna, yang biasanya diklasifikasikan berdasarkan afinitas kimianya: basa (misalnya hematoxylin, mereka mengikat struktur asam), asam (seperti eosin – mereka mengikat bagian dasar sel-) dan netral (mereka adalah acuh tak acuh dan noda kurang lebih sama semua bagian sampel).
Sampel siap untuk pengamatan Anda. Jika kita ingin preparasi menjadi permanen dan tahan lama, kita sekarang harus mengeringkan sampel lagi, karena resin yang digunakan untuk membuat perakitan akhir bersifat hidrofobik dan dengan demikian kita juga menjaga preparasi kita dari degradasi oleh berbagai mikroorganisme.
Pemasangan dilakukan pada kaca objek, menutupi sampel dengan kaca penutup.
Dalam kasus mikroskop elektron, prosedurnya serupa, meskipun kita tidak berbicara tentang pewarnaan tetapi tentang kontras, karena apa yang kita cari bukanlah perbedaan warna di berbagai bagian preparasi, melainkan beberapa area yang buram terhadap elektron. dan lain-lain transparan. Kami biasanya menggunakan garam logam berat.
Kriofraktur
Bahan dikeraskan dengan pembekuan cepat pada -150 ° C dalam nitrogen cair. Balok-balok tersebut diretak secara vakum dan tersingkap oleh sublimasi lapisan es superfisial: bidang rekahan selalu sesuai dengan area dengan hambatan paling kecil (membran). Dengan penguapan dengan karbon dan logam, replika (cetakan) dari permukaan yang retak dapat diperoleh. Struktur organik terlarut, oleh karena itu, yang diamati adalah replika.
Melalui teknik ini, fiksasi kimia dapat dihindari, sehingga risiko denaturasi struktur dapat dikurangi. Ini berlaku untuk banyak jenis sampel, tetapi hanya memungkinkan studi morfologis.