Pengurutan fragmen beberapa ratus nukleotida DNA telah menjadi prosedur otomatis yang dilakukan oleh peralatan khusus yang dirancang untuk tujuan ini. Berkat kecepatan metode ini, dimungkinkan untuk mengurutkan sejumlah besar organisme, termasuk genom manusia.
Metode ini didasarkan pada replikasi DNA in vitro dengan adanya nukleotida trifosfat termodifikasi yang memaksa sintesis rantai berakhir. Tujuannya adalah untuk mendapatkan campuran molekul dengan ukuran berbeda di mana terminasi ditemukan di setiap nukleotida rantai. Penambahan bahan kimia berwarna yang berbeda ke nukleotida terminator memungkinkan urutan untuk dibaca, baik dengan mata telanjang atau dengan pembaca optik terpasang ke komputer. Yang terakhir telah memungkinkan pembuatan apa yang disebut “sekuenser DNA”, yang memungkinkan proses dipercepat secara signifikan.
Melalui PCR kita dapat mengamplifikasi jumlah DNA dalam sampel
Hibridisasi asam nukleat .
DNA merupakan molekul yang cukup tahan terhadap kondisi ekstrim. Pada 100 ° C, ikatan hidrogen yang menahan dua untai DNA bersama-sama melemah dan untaian terpisah. Reaksi ini reversibel, dan rantai dapat dipasang kembali di bawah kondisi anil, umumnya pada suhu 65 ° C.
MRNA yang disalin dari salah satu untai DNA dapat dipasangkan dengan untai DNA yang berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukannya dalam kondisi reasosiasi, membentuk molekul DNA-RNA hibrid.
Properti ini menyediakan salah satu metode yang paling sensitif untuk mencari gen tertentu dalam molekul DNA.
Reaksi berantai polimerase.
Perkembangan pesat teknik yang terlibat dalam replikasi DNA telah memungkinkan penggandaan fragmen dengan panjang tertentu dalam tabung reaksi untuk mendapatkan gram molekul, kadang-kadang dimulai dari satu molekul.
Teknik ini disingkat dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dan dikembangkan oleh Kary Mullis (Hadiah Nobel 1993).
Untuk reaksi ini Anda harus memiliki:
- Inisiator : molekul DNA untai tunggal kecil yang melengkapi masing-masing ujung 3 daerah yang akan disalin.
- DNA polimerase dari bakteri, Thermus aquaticus (Taq), yang tahan suhu 100 ° C.
- Empat deoksiribonukleotida trifosfat.
- Larutan buffer yang sesuai, pada pH fisiologis dan kondisi salin yang sesuai.
Tekniknya terdiri dari memasukkan tabung dengan sampel ke dalam perangkat kecil yang mengatur suhu dalam siklus: sedemikian rupa sehingga suhu dinaikkan terlebih dahulu sehingga rantai DNA dipisahkan, dan kemudian diturunkan untuk memungkinkan inisiator menjadi dipisahkan, mengikat DNA dan DNA template disalin. Setelah salinan selesai, siklus dilanjutkan, menaikkan suhu hingga 100 ° C, di mana salinan yang baru direplikasi didenaturasi dan ini digunakan sebagai DNA cetakan, memperkuat reaksi. Ini benar-benar reaksi eksponensial.