Teknologi ini muncul sebagai tanggapan atas kebutuhan segmen genetik tertentu dalam jumlah yang cukup untuk analisis biokimia.
Metode ini melibatkan pemotongan segmen yang diinginkan dari DNA di sekitarnya dan menyalinnya jutaan kali.
Keberhasilan teknologi DNA rekombinan, dimana sel mikroba dapat direkayasa untuk menghasilkan protein asing.
Ini didasarkan pada pembacaan gen yang sesuai dengan mesin sel bakteri dan telah memicu sebagian besar kemajuan terbaru dalam biologi molekuler cararn.
Selama dua puluh tahun terakhir, studi tentang sekuens DNA kloning telah memberi kita pengetahuan terperinci tentang struktur dan organisasi gen.
Ini telah memberikan petunjuk untuk jalur regulasi dimana sel mengontrol ekspresi gen dalam beberapa jenis sel yang membentuk rencana tubuh vertebrata dasar.
Rekayasa genetika, di mana suatu organisme dapat dimodifikasi untuk memasukkan gen baru yang dirancang dengan karakteristik yang diinginkan, sekarang menjadi praktik umum di laboratorium penelitian dasar.
Ini telah menyediakan sarana untuk menghasilkan sejumlah besar protein normal dan mutan yang sangat murni untuk analisis rinci tentang fungsinya dalam tubuh.
Kemajuan terbaru dalam teknologi ini juga telah mengubah arah penelitian medis.
Pendekatan baru yang menarik sedang dikembangkan untuk mengeksploitasi potensi besar penelitian DNA rekombinan dalam analisis kelainan genetik.
Kemampuan baru untuk memanipulasi materi genetik manusia telah membuka jalan baru yang radikal untuk diagnosis dan pengobatan, dan memiliki konsekuensi yang luas untuk masa depan kedokteran.
Namun, prinsip dasar DNA rekombinan, seperti struktur DNA itu sendiri, ternyata sangat sederhana.
Kloning DNA
Kloning molekuler menyediakan sarana untuk mengeksploitasi pertumbuhan sel bakteri yang cepat untuk menghasilkan sejumlah besar fragmen DNA yang identik, yang saja tidak memiliki kemampuan untuk bereproduksi.
Fragmen DNA yang akan diamplifikasi terlebih dahulu dimasukkan ke dalam vektor kloning. Vektor paling populer saat ini digunakan terdiri dari molekul melingkar kecil DNA (plasmid) atau virus bakteri (fag).
Vektor mengandung informasi genetik yang memungkinkan mesin replikasi DNA bakteri untuk menyalinnya. Setelah penyisipan DNA asing, plasmid atau vektor fag diperkenalkan kembali ke dalam sel bakteri.
Kultur bakteri yang tumbuh mereplikasi DNA asing, bersama dengan vektor, dalam ratusan salinan per sel. Proses ini menghasilkan banyak dan klon identik dari molekul rekombinan asli.
Sangat mudah untuk memanen vektor dari kultur bakteri dan melepaskan fragmen DNA asing yang diamplifikasi dengan enzim restriksi yang sama yang digunakan untuk memasukkan fragmen DNA asli ke dalam vektor.
Kekuatan kloning molekuler luar biasa: satu liter sel bakteri yang dirancang untuk mengamplifikasi satu fragmen DNA manusia dari klon dapat menghasilkan kira-kira sepuluh kali jumlah segmen DNA spesifik yang dapat dimurnikan dari total konten seluler seluruh tubuh manusia…
Untuk analisis bentangan panjang DNA, vektor eukariotik telah dikembangkan yang dapat tumbuh dalam ragi yang dapat mengandung megabasa DNA asing.
Vektor ini meniru struktur kromosom ragi, sehingga bereplikasi bersama dengan kromosom ragi asli setiap kali sel ragi membelah.
Kromosom Buatan Ragi, atau YAC, seringkali merupakan satu-satunya cara untuk mengkloning gen yang sangat besar, termasuk intron besar, semuanya dalam satu bagian yang berkesinambungan.
YAC juga menyediakan cara untuk menyebarkan DNA dalam sel eukariotik , di mana modifikasi DNA, bagian penting dari mesin pengatur genetik eukariotik, lebih mungkin untuk dilestarikan (lebih lanjut tentang ini nanti).
YAC menjadi semakin berguna dalam banyak proyek genomik yang sedang berlangsung saat kita berusaha memahami struktur meta kromosom, di mana lokasi dan susunan gen di dalam DNA ‘sampah’ di sekitarnya mungkin berisi informasi peraturan yang belum ditemukan untuk pengemasan dan aksesibilitas.
Amplifikasi DNA rekombinan
Segmen DNA yang akan diamplifikasi dipisahkan dari DNA genom di sekitarnya dengan pembelahan enzim restriksi, yang sering menghasilkan ujung yang tidak rata atau lengket.
Dalam contoh yang diilustrasikan di sini, enzim restriksi EcoRI mengenali urutan palindromik GAATTC, dan memotong setiap untai antara G dan A (dua untai DNA genom berwarna hijau dan ungu).
Vektor plasmid (coklat) disiapkan untuk menerima fragmen DNA genom yang diisolasi dengan memotong DNA plasmid sirkular pada satu tempat dengan enzim restriksi yang sama.
Menghasilkan ujung lengket yang melengkapi ujung lengket dari fragmen DNA genom.
DNA genom yang dipotong dan plasmid yang dilinierkan dicampur bersama dengan adanya enzim ligase, yang mengikat ikatan pada tulang punggung DNA di kedua sisi persimpangan DNA genom plasmid.
Molekul DNA rekombinan ini kemudian dimasukkan ke dalam bakteri yang dapat menyerap DNA plasmid dan kemudian mereplikasi plasmid saat kultur tumbuh.
Mengapa rDNA penting?
DNA rekombinan menjadi semakin penting dalam beberapa tahun terakhir, dan itu hanya akan menjadi lebih penting di abad ke-21 karena penyakit genetik menjadi lebih sering dan area pertanian menyusut. Di bawah ini adalah beberapa area di mana DNA rekombinan akan berdampak:
Panen yang lebih baik (kekeringan dan tahan panas).
Vaksin rekombinan (yaitu, hepatitis B).
Pencegahan dan penyembuhan anemia sel sabit.
Pencegahan dan penyembuhan cystic fibrosis.
Produksi faktor pembekuan.
Produksi insulin.
Produksi produk farmasi rekombinan.
Tumbuhan yang menghasilkan insektisida sendiri.
Garis kuman dan terapi gen somatik.
Bagaimana cara kerja rDNA?
DNA rekombinan berfungsi ketika sel inang mengekspresikan protein dari gen rekombinan.
Tuan rumah tidak akan menghasilkan sejumlah besar protein rekombinan kecuali jika itu mengungkapkan faktor tambahan.
Ekspresi protein tergantung pada gen yang dikelilingi oleh kumpulan sinyal yang memberikan instruksi untuk transkripsi dan translasi gen oleh sel .
Sinyal-sinyal ini termasuk promotor, persimpangan ribosom, dan terminator. Vektor ekspresi, di mana DNA asing dimasukkan, mengandung sinyal-sinyal ini.
Sinyalnya spesifik spesies. Dalam kasus E. Coli, sinyal ini pastilah sinyal E. Coli karena kecil kemungkinannya E. Coli memahami sinyal dari promotor dan terminator manusia.