Dengan kloning DNA atau kloning gen , kita memahami perolehan banyak salinan gen atau produk gennya, biasanya protein.
Strategi yang digunakan terdiri dari penempatan fragmen DNA yang membawa gen yang bersangkutan ke dalam molekul DNA ekstrakromosomal yang bereplikasi sendiri (misalnya, plasmid bakteri), disertai dengan gen yang memungkinkan pemilihan molekul hibrida, di dalam bakteri, yang dapat berkembang biak di kecepatan tinggi membentuk klon (kelompok sel dengan gen yang sama) dan memungkinkan mesin bakteri untuk menyalin dan menerjemahkan segmen DNA yang telah kami perkenalkan. Untuk ini, Anda perlu:
Insulin manusia diperoleh hari ini dengan prosedur yang dijelaskan dalam artikel ini.
- Vektor kloning : ini adalah molekul DNA kecil yang dapat menggandakan diri. Mereka juga harus memiliki tempat pemutusan enzim restriksi dan gen resistensi antibiotik, atau gen lain yang berguna bagi kita untuk membedakan bakteri mana yang telah memasukkan DNA yang ingin kita klon dan mana yang tidak. Plasmid bakteri, partikel virus dan kromosom eukariotik ragi (“YAC”) dapat digunakan sebagai vektor. Penggunaannya ditentukan oleh ukuran fragmen yang akan dikloning dan oleh kemudahan ekspresi DNA dalam satu vektor atau lainnya. Jika vektor diperlukan sebagai vektor ekspresi, ia juga harus memiliki promotor yang kuat untuk transkripsi urutan yang disisipkan. Promotor dipahami sebagai urutan gen yang menginduksi produksi protein yang dicari. Untuk mencapai penyatuan fragmen DNA dan vektor, kedua molekul dibelah dengan enzim restriksi yang sama. Jika menghasilkan ujung kohesif, dalam kondisi reasosiasi, kedua molekul akan cenderung bersatu. Enzim DNA ligase memfasilitasi pembentukan ikatan fosfodiester, yang memastikan kontinuitas di setiap untai DNA hibrida yang terbentuk.
- Pemilihan DNA yang akan dikloning . Ini bisa menjadi segmen DNA dari urutan yang diketahui yang mengandung gen yang diinginkan. Dalam banyak kasus, ketika menyangkut DNA dari sel eukariotik, keberadaan intron membuat sangat sulit bagi bakteri untuk memproses RNA sebelum menerjemahkannya, karena tidak memiliki mesin enzim yang tepat. Dalam kasus ini, akan berguna untuk mengisolasi RNA pembawa pesan yang mengkode protein yang diinginkan, dan membuat salinan DNA-nya menggunakan transkriptase balik. Salinan ini disebut cDNA (DNA komplementer), tidak memiliki intron, dan mengekspresikan protein dengan benar di dalam bakteri.
- Pengenalan molekul hibrida ke dalam inang . Molekul hibrida yang dihasilkan dimasukkan ke dalam bakteri atau sel ragi untuk replikasi mereka, sebelum permeabilisasi mereka dengan perawatan kimia.
- Pemilihan klon dengan molekul hibrida . Klon hibrida dipilih untuk beberapa properti yang telah dimasukkan peneliti ke dalam molekul, misalnya resistensi terhadap antibiotik atau setelah mendeteksi hibridisasi positif dengan oligonukleotida yang melengkapi urutan DNA eksogen.
- Ekspresi protein yang menarik . Bakteri atau inang eukariotik tidak membedakan DNA asing dari DNA mereka sendiri, dan mesin seluler melanjutkan program genetik replikasi, transkripsi, dan translasi gen yang telah diperkenalkan. Dalam beberapa kasus, ekspresi protein telah dicapai hingga 1 persen dari total protein inang. Menggunakan teknik rekayasa genetika, bakteri dapat dibuat untuk mengeluarkan protein ke luar bakteri. Dengan cara ini, hasil protein yang luar biasa dapat dicapai dalam proses industri.
Saat ini, faktor VIII (protein yang dibutuhkan oleh penderita hemofilia), hormon pertumbuhan, insulin manusia, dan beberapa vaksin antivirus diperoleh dengan prosedur ini.