The kromatografi kolom mungkin metode umum yang paling digunakan untuk pemisahan, sedangkan untuk pemurnian berbagai senyawa organik dalam keadaan padat atau cair.
Pada kromatografi jenis ini, fase diam yang digunakan yaitu absorben ditempatkan di dalam kolom kaca, yang diakhiri dengan kunci untuk mengontrol lewatnya zat ke luar kolom. Fase diam diresapi dengan eluen atau fase gerak. Kemudian campuran organik yang ingin kita pisahkan diendapkan di bagian atas fase diam, dan dengan demikian fase gerak akan dapat melewati sistem.
Senyawa-senyawa yang terlarut dalam fase gerak lambat laun akan keluar dari kolom kromatografi, dan terkumpul dalam fraksi-fraksi. Fraksi yang kurang polar, yang umumnya memiliki sedikit atau tanpa retensi dalam penyerap, akan menjadi yang pertama keluar dari kolom. Di sisi lain, zat yang lebih polar dipertahankan untuk waktu yang lebih lama dalam penyerap, dan sering kali perlu menggunakan pelarut yang berbeda untuk meningkatkan polaritasnya sehingga mereka terperangkap oleh pelarut ini.
Waktu yang diperlukan untuk mengalirkan senyawa melalui kolom dikenal sebagai waktu retensi. Waktu ini bervariasi, karena karakteristik masing-masing senyawa dalam kondisi kromatografi tertentu, yang bervariasi sesuai dengan penyerap yang digunakan, pelarut, tekanan, diameter kolom yang digunakan, dll.
Penyerap yang paling umum digunakan untuk kromatografi kolom adalah silika gel. Kadang-kadang, sebagai pengganti silika gel, bila tidak sesuai dengan campuran yang akan dikromatografi, digunakan alumina atau florisil (magnesium silikat). Kromatografi kolom dapat dilakukan secara gravitasi atau pada tekanan sedang. Ketika dilakukan pada tekanan sedang, kepala kolom dihubungkan ke kompresor atau saluran udara tekan.
Ukuran partikel silika gel untuk kromatografi tekanan sedang harus lebih kecil daripada untuk kromatografi gravitasi. Jika dalam kromatografi gravitasi kita menggunakan silika gel dengan ukuran partikel yang lebih kecil, tidak akan terjadi elusi, karena aliran pelarut akan terhambat. Tetapi sebaliknya, jika kita menerapkan tekanan, maka karena gaya jika elusi oleh pelarut akan terjadi.
Karena penurunan ukuran partikel penyerap, pemisahan yang lebih efisien terjadi. Umumnya, kromatografi tekanan menengah menghasilkan hasil yang lebih baik daripada kromatografi gravitasi, dan juga karena lebih cepat, ini adalah yang paling banyak digunakan.
Ketika kita akan melakukan kromatografi kolom, hal pertama yang harus kita lakukan adalah memilih pelarut yang disesuaikan untuk kasus kita, untuk mengoptimalkan pemisahan komponen-komponen campuran. Operasi ini terjadi melalui kromatografi lapis tipis analitik. Varian yang paling berpengaruh dalam efisiensi pemisahan kromatografi tekanan sedang menggunakan silika gel adalah diameter kolom, serta jumlah gel yang digunakan.
Untuk memilih pelarut, terlebih dahulu dilakukan kromatografi lapis tipis sampel yang akan dianalisis. Pelarut harus menghasilkan pemisahan yang baik dari komponen campuran pada pelat, menempatkan komponen yang kurang polar pada Rf mendekati 0,3. Untuk kolom kecil, idealnya adalah menggunakan eluen yang kurang polar dibandingkan dengan hasil kromatografi pelat.
Kadang-kadang campuran pelarut digunakan dan elusi gradien dilakukan. Untuk ini, kromatografi dimulai dengan campuran pelarut dengan polaritas yang memadai untuk dapat memisahkan komponen yang memiliki Rf tertinggi, dan dengan demikian, setelah dikumpulkan, polaritasnya akan ditingkatkan secara bertahap untuk dapat memisahkan komponen yang lebih polar. Jika pelarut yang terlalu polar digunakan saat memulai kromatografi, komponen campuran akan terelusi bersama, yang akan menyebabkan pemisahan tidak terjadi. Salah satu campuran pelarut yang sering digunakan adalah heksana/etil asetat.