The polymerase chain reaksi -PCR- adalah salah satu kemajuan ilmiah besar dari abad ke-20 dan mungkin banyak dari abad ke-21. Prosedur ini memungkinkan replikasi rantai DNA atau RNA, mengkloningnya dan memperkuat jumlahnya untuk sejumlah besar eksperimen yang meningkat setiap hari. Kami telah mendedikasikan beberapa artikel dasar untuk subjek ini, seperti reagen PCR atau apa yang terjadi di dalam thermal cycler , mesin tempat PCR dilakukan.
Jenis khusus PCR adalah PCR waktu nyata, PCR kuantitatif, atau qPCR. PCR ini memungkinkan, berkat thermal cycler dan reagen luminescent yang disiapkan secara khusus, untuk membandingkan jumlah urutan nukleotida dan membandingkannya dengan yang lain. Ini adalah tes langsung dari gen mana yang diekspresikan dalam sampel yang diberikan – di mana permainan dimainkan dengan mengubah kondisi pertumbuhan kultur dari mana RNA diekstraksi sehingga gen yang berbeda diekspresikan.
Protokol qPCR sedikit berbeda dari PCR normal, meskipun operasinya pada dasarnya sama. Untuk memulainya, qPCR menggunakan polimerase – enzim yang akan menyalin rantai nukleotida – sangat sensitif dan dengan sedikit kesalahan penyalinan.
Perubahan besar lainnya antara PCR normal dan qPCR adalah bahwa yang terakhir tidak perlu dikembangkan pada gel. Sebuah kromofor, sering SYBR-Green , ditambahkan ke sampel . Pembentukan rantai salinan menghasilkan muatan yang diperlukan agar kromofor menyala. Hal ini memungkinkan pengendara sepeda termal untuk dapat melihat kapan cahaya dipancarkan dan intensitas di mana ia dipancarkan. QPCR selalu membandingkan beberapa sampel. Pengendara sepeda termal memungkinkan Anda untuk melihat di mana siklus replikasi cahaya mulai dipancarkan dan variasi jumlah cahaya di setiap siklus. Dengan melihat grafik emisi cahaya dari beberapa sampel simultan, dimungkinkan untuk menentukan mana yang memiliki cahaya paling banyak – dan karena itu jumlah transkripnya paling banyak.
Namun, qPCR memiliki persyaratan teknis yang jauh lebih tinggi daripada PCR. Untuk memulainya, sampel tidak dapat terkontaminasi sedikit pun, karena polimerase sangat sensitif. Selain itu, qPCr membutuhkan siklus yang jauh lebih sedikit sehingga bahkan jumlah kontaminasi yang sangat kecil – atau sudah degradasi sampel – dapat mengubah konsentrasi sampel dan oleh karena itu hasilnya.
Di sisi lain, ekstraksi harus sangat bersih, tidak hanya untuk menghindari kontaminasi dan degradasi sampel. Jumlah RNA, atau cDNA, yang diambil sampelnya harus sangat mirip antara sampel yang akan dibandingkan. Oleh karena itu, konsentrasinya sering harus diukur dan sampel disiapkan secara khusus.
Untuk menyelesaikan persiapan spesifik qPCR, perbandingan antara dua sampel – perlakuan dan kontrol – harus dilakukan berdasarkan referensi umum . Untuk ini, gen digunakan yang diekspresikan dengan cara konstituen – bahwa ekspresinya tidak bervariasi antara perlakuan dan kontrol.
Akhirnya, qPCR memerlukan replikasi teknis , biasanya 3 untuk setiap gen dan sampel, dengan cara ini kemungkinan kesalahan “pipetting”, perbedaan pengukuran karena pekerjaan mengukur sampel dan menyiapkan semua tabung yang akan dimasukkan, dapat dihindari. pengendara sepeda termal.
Meskipun proses biologis atau teknis qPCR sama dengan PCR, tujuannya jauh lebih spesifik dan persiapannya harus jauh lebih tepat.