Dalam kromatografi lapis tipis analitik , fase diam atau disebut fase penyerap ditempatkan secara merata, membentuk lapisan yang sangat tipis dengan ketebalan sekitar 0,1 mm, pada penyangga atau pelat kaca atau logam. Campuran yang ingin dianalisis akan ditempatkan agak jauh dari tepi bawah pelat tersebut, yang akan kita masukkan ke dalam kuvet atau wadah yang akan berisi fase gerak, atau disebut juga eluen. Fasa gerak akan naik sedikit demi sedikit pada pelat fasa diam melalui aksi kapiler, menggantikan berbagai komponen campuran yang akan dianalisis, pada kecepatan yang berbeda, yang akan menyebabkan pemisahan campuran. Ketika bagian depan pelarut berada di dekat bagian atas pelat, kami akan mengeluarkan pelat dari ember untuk membiarkannya kering sehingga kami dapat melihat noda dari komponen yang berbeda.
Perbandingan jarak yang ditempuh senyawa dan pelarut, dari titik asal kromatogram, dikenal sebagai Rf (faktor laju), yang memiliki nilai konstan untuk setiap senyawa dalam kondisi tertentu. Kondisi tersebut dapat berupa jenis penyerap yang digunakan, ukuran baki, suhu, pelarut, dll. Hal ini tidak mungkin untuk mereproduksi persis kondisi eksperimental, sehingga satu sampel biasanya dibandingkan dengan yang lain, keduanya dielusi dalam piring yang sama. Jadi, untuk menghitung Rf, rumus berikut diikuti:
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa / Jarak yang ditempuh pelarut
Jarak yang ditempuh oleh senyawa biasanya diukur dari pusat noda, itulah sebabnya tanda biasanya dibuat di piring, jika noda ini sangat besar, nilai Rf akan salah. Jadi, kami membuat beberapa tanda di piring tempat kami akan menyimpan sampel minimum dengan bantuan pipet.
Semakin polar suatu senyawa maka akan semakin terperangkap di dalam absorben, sehingga akan semakin lambat dan Rfnya juga akan semakin rendah. Di sisi lain, senyawa polar rendah dipindahkan lebih jauh dari asalnya. Polaritas pelarut mempengaruhi nilai Rf, jadi kita harus memperhitungkannya. Jadi, untuk jenis senyawa yang sama, peningkatan polaritas pelarut akan meningkatkan perpindahannya pada pelat dan oleh karena itu juga meningkatkan Rfnya.
Untuk memilih eluen, disarankan untuk memilih pelarut yang komponen penyusun campurannya memiliki Rf sekitar 0,3 atau 0,5. Untuk menemukan eluen yang ideal, perlu untuk mencoba pelarut yang berbeda dengan polaritas yang berbeda atau dengan campuran beberapa dari mereka. Dalam kasus ini, kita harus beralih ke pelarut yang kurang lebih polar.
Dalam kasus senyawa polar rendah, yang bergerak dari asal cukup mudah, pelarut apolar digunakan, umumnya heksana . Untuk senyawa dengan polaritas sedang, disarankan untuk menggunakan campuran heksana / etil asetat dalam proporsi yang berbeda tergantung pada polaritasnya. Produk yang paling polar dari semuanya, yang sangat tertahan dalam penyerap, membutuhkan pelarut yang lebih polar seperti metanol atau campuran metilen klorida / metanol yang berbeda dalam proporsi yang berbeda.
Setelah kromatografi dilakukan, kami melanjutkan ke visualisasinya. Kebanyakan pelat kromatografi mengandung produk indikator fluoresen yang memungkinkan visualisasi senyawa yang aktif dalam sinar ultraviolet, khususnya pada 254 nm. Indikator menyerap sinar UV , dan memancarkan cahaya tampak, biasanya berwarna hijau. Kehadiran senyawa aktif yang ditemukan di UV mencegah indikator ini menyerap cahaya di bagian tempat kami meletakkan produk, yang berarti melihat noda di piring, yang menunjukkan adanya senyawa tertentu..
Ketika datang ke senyawa yang gagal menyerap sinar UV, tampilan kromatogram membutuhkan penggunaan pengembang. Pengembang tersebut harus bereaksi dengan produk yang diserap, memberikan senyawa berwarna. Oleh karena itu, pengembang yang digunakan tergantung pada jenis senyawa yang ingin kita visualisasikan.