Reaksi Rantai Polimerase: Apa itu? Bagaimana cara kerjanya? dan Panggung Utama

PCR adalah teknik yang digunakan di laboratorium untuk membuat jutaan salinan bagian tertentu dari DNA. Ini pertama kali dikembangkan pada 1980-an.

Apa itu PCR?

Reaksi berantai polimerase atau PCR (untuk akronimnya dalam bahasa Inggris), awalnya dikembangkan pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Amerika Kary Mullis. Dia dianugerahi Penghargaan Nobel dalam Kimia 1993 untuk karya perintisnya.

PCR digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat banyak salinan (menguatkan) bagian kecil DNA atau gen.

Menggunakan PCR dimungkinkan untuk menghasilkan ribuan atau jutaan salinan bagian DNA tertentu dari sejumlah kecil DNA.

PCR adalah alat yang umum digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi. Ini digunakan pada tahap awal pemrosesan DNA untuk pengurutan, untuk mendeteksi ada atau tidak adanya gen yang membantu mengidentifikasi patogen selama infeksi, dan untuk menghasilkan profil DNA forensik dari sampel DNA kecil.

Bagaimana reaksi berantai polimerase bekerja?

Prinsip di balik setiap reaksi berantai polimerase, apa pun sampel DNA-nya, adalah sama. Lima “bahan” inti diperlukan untuk menyiapkan PCR. Kita akan menjelaskan dengan tepat apa yang masing-masing dari mereka lakukan seiring berjalannya waktu.

Ini adalah:

Template DNA yang akan disalin.

Primer, rangkaian pendek DNA yang memulai reaksi PCR, dirancang untuk mengikat kedua sisi bagian DNA yang ingin Anda salin.

Basa nukleotida DNA (juga dikenal sebagai dNTP). Basa DNA (A, C, G dan T) adalah bahan penyusun DNA dan diperlukan untuk membangun untai DNA baru.

Enzim taq polimerase untuk menambahkan basa DNA penyangga baru untuk menjamin kondisi yang tepat untuk reaksi.

PCR melibatkan proses pemanasan dan pendinginan yang disebut siklus termal yang dilakukan oleh mesin.

Ada tiga tahap utama

Denaturasi:

Ketika DNA template untai ganda dipanaskan untuk memisahkannya menjadi dua untai tunggal.

anil:

Ketika suhu diturunkan untuk memungkinkan primer DNA mengikat DNA template.

Perpanjangan:

Saat suhu naik dan untai DNA baru diproduksi oleh enzim Taq polimerase. Ketiga langkah ini diulang 20 sampai 40 kali, menggandakan jumlah salinan DNA setiap kali.

Reaksi PCR lengkap dapat dilakukan dalam beberapa jam, atau bahkan kurang dari satu jam, dengan mesin berkecepatan tinggi tertentu.

Setelah PCR selesai, metode yang disebut elektroforesis dapat digunakan untuk memeriksa jumlah dan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan.

Apa yang terjadi pada setiap tahap PCR?

Tahap denaturasi:

Selama tahap ini, koktail yang mengandung DNA templat dan semua bahan inti lainnya dipanaskan hingga 94-95⁰C. Temperatur yang tinggi menyebabkan ikatan hidrogen antara basa pada dua untai DNA cetakan putus dan kedua untai terpisah.

Ini menghasilkan dua untai DNA tunggal, yang akan bertindak sebagai cetakan untuk produksi untaian DNA baru. Penting bahwa suhu dipertahankan pada tahap ini cukup lama untuk memastikan bahwa untaian DNA telah benar-benar terpisah.

Ini biasanya memakan waktu antara 15-30 detik.

Tahap anil:

Selama langkah ini, reaksi didinginkan hingga 50-65 ° C. Hal ini memungkinkan primer untuk melekat pada lokasi tertentu pada DNA template untai tunggal melalui ikatan hidrogen (suhu yang tepat tergantung pada suhu leleh primer yang Anda gunakan).

Primer adalah untai tunggal DNA atau RNA, yang panjangnya sekitar 20 hingga 30 basa. Yang pertama dirancang untuk melengkapi urutan bagian pendek DNA di setiap ujung urutan yang akan disalin.

Primer berfungsi sebagai titik awal untuk sintesis DNA. Enzim polimerase hanya dapat menambahkan basa DNA ke untai ganda DNA. Hanya setelah primer terikat, enzim polimerase mengikat dan mulai membentuk untai DNA komplementer baru dari basa DNA lepas.

Dua untai DNA yang terpisah saling melengkapi dan berjalan dalam arah yang berlawanan (dari satu ujung – ujung 5 ‘ke ujung lainnya – ujung 3’); sebagai hasilnya, ada dua primer: primer maju dan primer terbalik.

Langkah ini biasanya memakan waktu sekitar 10-30 detik.

Tahap ekstensi:

Selama langkah terakhir ini, panas dinaikkan hingga 72 ° C untuk memungkinkan DNA baru dibuat oleh enzim Taq DNA polimerase khusus yang menambahkan basa DNA.

Taq DNA polimerase adalah enzim yang diambil dari bakteri yang menyukai panas. Bakteri ini biasanya hidup di sumber air panas, sehingga dapat mentolerir suhu di atas 80 °C.

DNA polimerase bakteri sangat stabil pada suhu tinggi, yang berarti dapat menahan suhu yang diperlukan untuk memisahkan untaian DNA pada tahap denaturasi PCR.

DNA polimerase dari sebagian besar organisme lain tidak dapat menahan suhu tinggi ini, misalnya polimerase manusia bekerja idealnya pada 37 ° C (suhu tubuh). 72⁰C adalah suhu optimal untuk Taq polimerase untuk membangun rantai komplementer.

Ini mengikat primer dan kemudian menambahkan basa DNA ke untai individu satu per satu dalam arah 5 ‘ke 3’.

Hasilnya adalah untai DNA baru dan molekul DNA untai ganda. Durasi langkah ini tergantung pada panjang urutan DNA yang diamplifikasi, tetapi biasanya diperlukan waktu sekitar satu menit untuk menyalin 1.000 basa DNA (1Kb).

Ketiga proses siklus termal ini diulang 20-40 kali untuk menghasilkan banyak salinan urutan DNA yang diinginkan. Fragmen DNA baru yang dihasilkan selama PCR juga berfungsi sebagai cetakan di mana enzim DNA polimerase dapat mengikat dan mulai memproduksi DNA.

Hasilnya adalah sejumlah besar salinan segmen DNA spesifik yang diproduksi dalam waktu yang relatif singkat.

Related Posts